NAUČNICI IZ SRBIJE PRAVE REVOLUCIJU U MEDICINI: Dr Knežević nam je otkrio sve o fenomenalnom projektu PHANTER!

Dr Petar Knežević, redovni profesor Prirodno-matematičkog fakulteta u Novom Sadu je rukovodilac projekta koji je dobio novčanu podršku od Republike Srbije za istraživanje u okviru Programa PROMIS. Njegov projekat je jedan od 59 koji su dobili priliku da unaprede svakodnevni život ljudi svojim istraživanjem i otkrićima.

Novi projekat tiče se sinergizma između faga i antibiotika u borbi protiv bakterija. Kako bismo najbolje razumeli značaj novih terapija koje naši naučnici planiraju da plasiraju odlučili smo da kontaktiramo upravo rukovodioca i saznamo da li smo na pragu novog načina života.

Zahvaljujući Vašem predlogu projekta, Vaša institucija i projektni tim su dobili skoro 200.000 evra od države za istraživanje terapije fagima. Zašto je bitna ova terapija i u šta ćete uložiti taj novac, kao i šta je tačno projekat PHANTER?

- PHANTER je projekat Departmana za biologiju i ekologiju (PMF, Univerzitet u Novom Sadu) finansiran od strane Fonda za nauku Republike Srbije u okviru programa PROMIS. Kako trenutna terapija bakterijskih infekcija uvek uključuje antibiotike, vizija učesika projekta PHANTER je da fagi mogu biti uvedeni u terapiju kroz kombinovanje sa konvencionalnim antibioticima. Štaviše, prethodna istraživanja članova tima pokazala su da fagi i antibiotici mogu sinergistički ubiti bakterije, tj. da mogu biti mnogo efikasniji u kombinaciji, nego kada se primene pojedinačno. Članovi projektog tima PHANTER su bili među pionirima u ovim istraživanjima, jer su među prvima su ukazali na postojanje sinergizma. Opšti cilj ovog projekta je da se unapredi trenutna borba protiv multiplo i panrezistentnih bakterija sprovođenjem predkliničkih istraživanja kombinacije bakteriofaga i antibiotika kao terapijske alternative, što će biti osnova za buduća klinička ispitivanja i nove pristupe u lečenju bakterijskih infekcija - objašnjava prof. Knežević.

On dodaje i da projekti uvek imaju budžet sa strukturom koju određuje finansijer i nije moguće odstupiti od nje. Veliki deo sredstava budžeta koji je namenjen projektu iskoristiće se za kupovinu opreme i potrošni materijal.

Ako sve protekne po planu, šta će Srbija (svet) dobiti posle vašeg projekta?

- Mi smo mikrobiolozi i naša istraživanja su fundamentalna. Rezultati našeg projekta bi trebalo da budu osnova harmonizacije standardne terapije antibioticima sa bakteriofagima, jer bi nagli prelazak sa jednih na druge agense praktično bio nemoguć. Rezultati će pre svega imati značaja u centrima gde se koriste bakteriofagi, a nadamo se da će naš projekat zainteresovati i lekare i veterinare iz Srbije i da će bar jedan takav centar biti otvoren i kod nas u bliskoj budućnosti. Rezultati projekta PHANTER i saradnje koje smo ostvarili mogli bi puno doprineti tom poduhvatu - dodaje prof. Knežević.

U kojoj je trenutno fazi projekat?

- U toku prve godine realizacije projekta dizanirana je nova metoda za procenu sinergizma faga i antibiotika u mikroplejt formatu, koji je mnogo ekonomičniji, precizniji i omogućava širok opseg testistiranja različitih koncentracija faga i antibiotika, a sama metoda može postati zlatni standard u ovakvim istraživanjima. Primenom ove metode ispitivan je sinergizam između bakteriofaga koji inficiraju bakteriju Staphylococcus aureus i antibiotika koji se najčešće koriste u terapiji. Utvrđeno je da je sinergizam izraženiji kada se oba agensa primene istovremeno, nego kada se primeni jedan agens, pa se posle nekoliko časova primeni drugi. Posebno interesantni su rezultati kojima je potvrđen sinergizam između antibiotika i stafilokoka koje su poznate kao MRSA (meticilin rezistentne stafilokoke), a koje su poslednjih nekoliko decenija veliki terapijski problem, jer pokazuju visok stepen rezistencije na antibiotike iz grupe betalaktama. Ovi rezultati će biti osnov za kliničke studije ispitivanja sinergizma, što bi u budućnosti moglo da rezultira uvođenjem novih strategija u terapiji i boljem izlečenju infekcija koje uzrokuju bakterije rezistentne na antibiotike - kaže Petar i dodaje:

- Pored toga, sinergizam se ostvaruje primenom niskih koncentracija antibiotika i sa manjom brojnosti faga nego kada se ovi agensi koriste pojedinačno, pa se na taj način mogu izbeći neželjena dejstva antibiotika (alergije, mutageno delovanje i sl). Većina bakterija je već prirodno inficirana bakteriofagima, ali su oni pritajeni u njima i ne ubijaju ćeliju. Sprovedeni su i eksperimenti koji su potvrdili da niske doze pojedinih antibiotika mogu pokrenuti i ove fage da ubiju bakterije, što takođe doprinosi sinergizmu i delimično rasvetljava jedan od mehanizama ovog fenomena. Poznavanje mehanizma sinergizma faga i antibiotika bi moglo da se iskoristiti za bolje iskorištavanje ovog fenomena u terapiji. Ispitaćemo i kombinacije na bakteriji Pseudomonas, primenu faga iz familija koje do sada nisu ispitivane sa aspekta terapije, a izvršićemo i analize genoma faga, da bismo odbacili one sa nepoželjnim genima.

Šta su tačno fagi i zašto su bitni?

- Bakteriofagi ili fagi su virusi bakterija koji mogu efikasno da uništavaju bakterije i proučavani su kao potencijalni antibakterijski agensi još od njihovog otkrića. Ubrzo su otkriveni antibiotici i primena faga je napuštena, sve do početka 21. veka, kada su ponovo postali interesantni, zbog pojave rezistencije bakterija na antibiotike. Mada se primena faga ponovo intenzivno poučava poslednje dve decenije, oni još uvek nisu u rutinskoj medicinskoj praksi. Pored toga što efikasno ubijaju bakterije, fagi mogu bakterijama povećati virulenciju, olakšati im preživljavanje nepovoljnih uslova i mogu posredovati u genetičkoj razmeni između bakterija. Zbog toga na projektu izučavamo i ove moguće negativne posledice, kako bi se one blagovremeno sprečile. Fagi su u prirodi važni u regulaciji brojnosti bakterija, najbrojniji su biološki entiteti na planeti i ima ih svuda gde ima i bakterije domaćina, pa tako i u našem organizmu. Sa druge strane, fagi su već puno pomogli čovečanstvu, jer su prvi sekvencirani genomi bili upravo genomi faga, a rad na njima je pokazao da je DNK nasledni materijal, pa možemo reći da se molekularna biologija izdvojila kao grana biologije zahvaljujući proučavanju faga. Oni se koriste i u biotehnologiji, kao vektori za kloniranje, zatim u tehnici koja se zove „phage display“ i u mnoge druge svrhe - objašnjava prof. Knežević.

Koliko je velika opasnost od rezistencije na antibiotike? Koje bakterije predstavljaju najčešću opasnost, u ovom kontekstu?

- Najčešće se u tom kontekstu spominje grupa ESKAPE bakterija, u koju spadaju enterokokus, stafilokokus, klebsiela, acinetobakter, pseudomonas i enterobakter. Trebalo bi spomenuti i druge enterobakterije, npr. ešerihiju, salmonelu, šigelu, ali i klostridijum, streptokoke, mikobakterijum, najseriju i kampilobakter. Naravno da gotovo sve bakterije stiču rezistenciju i mogu predstavljati problem u terapiji, a infekcije uzrokovane rezistentnim bakterijama često imaju i smrtni ishod. Ove bakterije imaju različite mehanizme kojima ostvaruju rezistenciju, a jedna bakterija može posedovati više različitih mehanizama, što predstavlja veliki problem u izboru antibiotika. Zato smo se u našim istraživanjima, između ostalog, fokusirali na nekonvencionalne antimikrobne agense, a posebno na bakteriofage

Koji je trenutno najveći problem u terapiji fagima i kako ga možemo prevazići?

- Kada je u pitanju primena faga, problemi su više tehničke nego praktične prirode. Mnogima tretman virusima već zvuči zastrašujuće, a loša reklama u nekim delovima sveta je i to što se nazivaju „Staljinovi lekovi“, što obično ima negativne konotacije. Postoji i problem zaštite preparata na tražištu, jer su bakteriofagi mikroorganizmi, a ne hemijski agensi, pa je teško patentirati soj faga, ili preparat. Jedan od značajnih problema je nedostatak dovoljno sistematičnih kliničkih studija i što se bez obzira na vrtoglavi napredak čovečanstva, nove stvari ne prihvataju tako lako.

Može li se očekivati da će fagi u nekom trenutku u budućnosti zameniti antibiotike?

- Iskreno se nadam da će fagi ili njihovi enzimi bar delimično zameniti antibiotike u budućnosti. Možda je moj odgovor previše bojažljiv, kada se uporedi sa radom objavljenim u Frontiers in Microbiology, u čijem sam publikovanju učestvovao kao jedan od urednika, a koji futuristički opisuje primenu faga u 2035. godini. U radu je data idealna slika budućnosti terapije fagima, koja će podrazumevati primenu svih modernih tehnologija i biće visoko personalizovana. Posle kraćeg većanja kao urednici smo odlučili smo da se rad ipak publikuje, jer senzacionalizam može pomoći da se lakše prihvate inovacije. Ja lično nisam toliki optimista, ali će primena faga svakako naći svoje mesto u savremenom sistemu, u slučaju infekcija multiplorezistentnim bakterijama, što će biti sve češći slučaj u budućnosti.

Koja je komparativna prednost buduće terapije fagima u odnosu na antibiotsku terapiju?

- Primena faga ima jako puno prednosti u odnosu na antibiotike, a pokušaću da izdvojim samo neke. Najveća prednost je ta što fagi ubijaju samo ciljanu patogenu bakteriju, dok antibiotici ubijaju mnoge bakterije u našem organizmu, uključujući i one koje normalno žive u crevima, vagini, usnoj duplji i sl. i koje omogućavaju da naši organi adekvatno funkcionišu. Dakle, dijareja ili kandidijaza se prilikom primene faga ne pojavljuju, što je čest slučaj sa primenom antibiotika. Takođe, neki agensi koji se koriste u terapiji su dobijeni sintetskim putem, dok su fagi uvek prirodni, izolovani iz spoljašnje sredine. Broj antibiotika je vrlo ograničen, dok vrsta faga ima jako puno i uvek je moguće relativno brzo i lako izolovati nove fage. Fagi su virusi i umnožavaju se, a antibiotici su hemijski agensi i nemaju tu mogućnost, pa se brojnost faga od momenta aplikacije povećava, dok se patogena bakterija potpuno ne eliminiše. Poznato je da antibiotici uzrokuju alergijske reakcije, a neki su čak i mutageni i teratogeni, dok fagi ne izazivaju ove nepoželjne posledice. U vezi sa tim, neki antibiotici se ne koriste u pedijatriji, a fagi su bezbedni za primenu bez obzira na starosnu dob. To bi bile samo neke od prednosti, a svakako ih ima još.

Uz pomoć države, postoji li šansa da se Srbija pozicionira kao jedan od lidera u ovoj oblasti? Koliko je naučnicima bitno da njihov rad bude prepoznat na ovaj način?

- Srbija ima odlične predispozicije da postane lider u ovoj oblasti, jer su fagi brend Istočne Evrope i imali bismo odličnu prepoznatljivost. Takođe, naša znanja vezana za biologiju faga koriste drugi centri u svetu, a to bi trebalo primeniti prvenstveno u Srbiji. Uz entuzijazam lekara, naše znanje, saradnje koje smo ostvarili i neznatnu pomoć države to i ne bi bilo teško realizovati, a mogli bismo postati lider u oblasti kombinovane terapije faga i antibiotiika, jer takav centar ne postoji koliko je meni poznato. Naš rad je vezan za laboratoriju, ali bez obzira da li su u pitanju fundamentalna ili aplikativna istraživanja, svakom naučniku je cilj da rezultati njegovog rada na kraju nađu i svoju praktičnu primenu i da pomognu čovečanstvu.

Da li se svi bakteriofagi mogu koristiti u terapiji ili postoje neki kriterijumi za njihov izbor?

- Postoje dve grupe faga, oni koji ubijaju bakterije i oni koji ih inficiraju, ali ih ne ubijaju odmah, već im menjaju osobine, pa bakterije postaju bolje adaptirane na različite nepovoljne uslove. Zato su sa aspekta terapije poželjni isključivo fagi iz prve grupe, koje zovemo obligatno litički. Fagi namenjeni za terapiju moraju imati nizak potencijal prenošenja genetičkog materijala između bakterija, jer se tako smanjuju nepoželjne posledice njihove primene. Ovi fagi moraju da budu efikasni u eliminaciji bakterija i ne smeju kodirati neke nepoželjne gene. Kada je u pitanju kombinovanje sa antibioticima, kombinacije moraju biti takve da se ostvari sinergizam ili aditivni efekat, jer nekada interakcije mogu biti i antagonističke. Dakle, bakteriofagi moraju biti jako pažljivo odabrani.

Da li je moguća genetička manipulacija faga kako bi postali adekvatni za određenu bakteriju?

- Još pre nekih deset godina genetičkim inženjerstvom su napravljeni prvi bakteriofagi tog tipa namenjeni u terapiji, koji inficiraju bakterije, ubijaju ih, a ne umnožavaju se. Genetičkim manipulacijama moguće je dobiti idealne terapeutske fage, ali se postavlja pitanje primene genetički modifikovanih organizama, što trenutno i nije popularno. Kada govorimo o genetičkom inženjerstvu, u tom kontekstu su interesantniji ličtički enzimi faga, koji takođe efikasno ubijaju bakterije, a neki su u terapeutske svrhe modifikovani baš na taj način i zovu se artilizini. Artilizini imaju veoma širok spektar delovanja na različite bakterije i svakako su alternativa i antibioticima i fagima, ali je njihova proizvodnja još uvek skupa.

Mogu li bakterije postati fago-rezistentne?

- Imam jednu lošu i jednu dobru vest kada je u pitanju rezistencija bakterija na fage. Loša je što bakterije obično razvijaju rezistenciju na fage, čak i mnogo češće nego na antibiotike. A dobra vest je da ima jako puno vrsta faga, mnogo više nego antibiotika i uvek se mogu izolovati novi fagi. I sami fagi mogu da mutiraju i da prevaziđu bakterijske mehanizme rezistencije na infekciju, što se u prirodi neprestano dešava. Postoje i drugi načini da se ovaj problem prevaziđe, kao što je na primer kombinovanje faga, tj. priprema preparata koji su koktel više vrsta faga.

Postoje li skrivene opasnosti od terapije fagima?

- Fagi ne inficiraju naše ćelije i ne izazivaju alergijske reakcije. Opasnosti koje možemo da predvidimo su prenošenje genetičkog materijala sa jedne bakterije na drugu, što se naziva transdukcija, ali se i to može prevazići pravim izborom terapeutskih faga. Druga opasnost koju možemo da predvidimo i sprečimo je prisustvo nekih nepoželjnih gena u genomu faga, npr. onih koji kodiraju toksine. Fagi koji se koriste u terapiji moraju imati sekvenciran genom, pa se nakon analize genoma ovakvi fagi isključuju iz primene. Takođe, fagi se umnožavaju u bakterijskim kulturama i u preparatima faga se mogu naći i bakterijski toksini, zbog čega je preparate faga neophodno jako dobro prečistiti, da ne bi došlo do intoksikacije. Verovatno postoje i neke druge opasnosti koje ne mogu da se predvide u ovom momentu.

Koliko je trenutno raširena klinička terapija fagima? Postoji li ovakva primena u Srbiji i koliko će biti potrebno da ona postane "mainstream"?

- Ova terapija se već više od jednog veka koristi u nekim bivšim republikama Sovjetskog saveza, kao što je Gruzija, a poslednje dve decenije i u Poljskoj, Belgiji, USA, Australiji i drugim centrima. Nažalost, u Srbiji se ova terapija ne koristi, ali se nakon projekta PHANTER i to može promeniti. Kao što sam rekao, fagi su brend istočne evrope i to bi trebalo iskoristiti. Interesantno je da se smatra da je jedan od razloga operacije Barbarosa tokom drugog svetskog rata, koja je bila prekretnica za poraz fašističkih sila, bila motivisana željom Hitlera da se domogne „Staljinovih lekova“, jer je SSSR koristio fage, a antibiotici još nisu bili u primeni. Danas se primena faga proučava i u tzv. „zapadnoj medicini“, mnogo intenzivnije i sistematičnije. Nažalost, mi smo mala zemlja i pored toga što imamo vrhunske naučnike, rezultate njihovog istraživanja često iskoristi neko drugi, a nama stigne gotov, inovirani proizvod, koji onda bez reči prihvatamo. Kada sam spomenuo istoriju, reći ću i da smo se u prošlosti pokazali kao veoma hrabar narod, ali nam na intelektualnom bojnom polju nedostaje hrabrosti, bez pravog razloga. U Srbiji primena faga može početi već sutra, a možda neće početi ni 2035. godine – to zavisi samo od nas.

Da li ste do sada posetili neki od centara za terapiju fagima i kakvi su Vaši utisci? Kako će se primenjivati ova terapija, na kašičicu, injekcijom, kao aerosol?

- Posetio sam Eliava institut u Tbilisiju, gde se ispituje primena faga još od njihovog otkrića. U Gruziji možete kupiti preparate faga u apotekama bez lekarskog recepta i to su preparati za oralnu i lokalnu upotrebu. Zbog toga je jako teško sistematizovati podatke o uspešnosti terapije fagima na osnovu gruzijskog iskustva. Više puta sam posetio i Institut za eksperimentalne terapije u Vroclavu, gde jedinicu faga vodi akademik prof. Gorski sa kojim imamo izuzetno lepu saradnju. Primena faga na ovom institutu je pod strogom kontrolom i tamo se leče samo pacijenti za koje su iscrpljene sve opcije zvanične medicine, tj. oni koji su inficirani multiplo i panrezistentnim bakterijama. Pre dve godine sam na poziv Mikrobiološkog društva Australije održao predavanja na više australijskih univerziteta i imao priliku da posetim Westmead institut za medicinska istraživanja na kome se intenzvino proučava primena faga i na kojem radi moja bivša doktorandkinja. Čini mi se da je u Australiji lestvica podignuta još više, kada je u pitanju primena faga i oni takođe imaju veoma ohrabrujuće rezultate, posebno kada je u pitanju sistemska primena faga.

U toku studija i karijere dobili ste veći broj nagrada i priznanja. Da li biste mogli da izdvojite neku koja Vama posebno znači?

- Od svih nagrada meni je lično najdraža nagrada za najboljeg studenta Univerziteta, koju mi je dodelio Univerzitet u Novom Sadu kada sam diplomirao. Kao profesor primetio sam da studenti kada diplomiraju imaju određenu krizu, jer su završili jedno poglavlje života i suočavaju se sa stvarnim svetom. Slično se desilo i meni i ta nagrada mi je puno pomogla u tim trenucima i ohrabrila me da sledim svoj put. Posebno mi je bilo drago kada je prošle godine u zgradi Rektorata otvorena izložba sa stalnom postavkom fotografija najboljih studenata Univerziteta u Novom Sadu od 1996. do danas, jer je to dokaz da umemo da cenimo prave vrednosti. Naše najveće bogatstvo i jesu mladi, vredni i pametni ljudi.

Da li je naučnicima iz Srbije teško da publikuju rezultate svojih istraživanja u međunarodnim časopisima?

- Kvalitet naučnih istraživanja raste iz godine u godinu., o čemu mogu da posvedčim svojim iskustvom i kao autor i kao urednik u vrhunskim međunarodnim časopisima Frontiers in Microbiology i Viruses. Na primer, kada sam doktorirao, pre nekih desetak godina, većina publikovanih radova u oblasti antibakterijske aktivnosti faga nije imala sekvence genoma faga. Danas je nemoguće objaviti bilo šta na tu temu, ako genomi korišćenih faga nisu sekvencirani i analizirani. Drago mi je da nauka brzo napreduje, a još mi je draže što naši naučnici uspevaju da idu u korak sa svetom, iako to nije uvek lako. Iskreno se divim svim kolegama za svaki objavljeni rad, jer znam koliko rada i truda stoji iza svake reference.

Da li trenutno rukovodite i drugim projektima i čime se još bavite?

- U PK Labu se pored projekta PHANTER realizuje i projekat u okviru poziva "Dokaz koncepta", koji finansira Fond za inovacionu delatnost, na kome ispitujemo primenu molekula dobijenih iz biljaka u uklanjanju biofilma, jer biofilm dodatno doprinosi rezistenciji bakterija. Pored toga razvijamo i model za ispitivanje anti-koronavirusne aktivnosti korišćenjem animalnih virusa, što će biti daleko bezbednije nego rad sa SARS-CoV-2, a projekat finansira Pokrajinski sekretarijat za visoko obrazovanje i naučnoistraživačku delatnost. Ispitujemo i druge antibakterijske i antivirusne agense, kako sintetičke tako i prirodne, proučavamo biologiju filamentoznih faga različitih bakterija, kao i ulogu humanih virusa iz novootkrivene familije Redondoviridae u etiologiji paradontopatije i u kancerogenezi.

Naučnici očekuju na kraju projekta PHANTER dugoročan efekat koji će se odraziti na ekonomiju, unapređivanje zdravlja ljudi, ali i uticaj na životnu sredinu. Da li će u tome naši naučnici uspeti ostaje nam da vidimo, a mi se nadamo da kada budu promenili ovaj svet neće zaboraviti našu Srbiju.

Bonus video:

(Espreso)